KAEDAH PEMBUDAYAAN MIKROORGANISME. KAJIAN KEBUDAYAAN DAN BIOSEMIK
HARTA
Penanaman, iaitu penanaman mikroorganisma di makmal, digunakan untuk mengkaji sifatnya dan mendapatkan biomas. Bakteria, kulat, actinomycetes, spirochetes dan beberapa protozoa ditanam pada media nutrien. Klamidia, rickettsia, virus dan beberapa protozoa hanya dapat membiak dalam tubuh haiwan atau dalam sel hidup.
Sifat budaya mikroorganisma jenis ini adalah: 1) keadaan yang diperlukan untuk pembiakan, dan 2) sifat pertumbuhan pada media nutrien. Sifat budaya adalah salah satu ciri yang diambil kira semasa mengenal pasti (menentukan jenis) mikroorganisma.
Media budaya
Media budaya mesti memenuhi syarat tertentu. Mereka mesti mengandungi semua nutrien yang diperlukan untuk pembiakan mikrob jenis ini. Beberapa mikroorganisma patogen tumbuh pada media nutrien sederhana, sementara yang lain memerlukan penambahan darah, serum darah, dan vitamin untuk pembiakannya.
Dalam media kultur, syarat-syarat tertentu mesti dibuat dengan menambahkan larutan natrium klorida atau buffer. Bagi kebanyakan bakteria, medium nutrien yang mengandungi 0,5% natrium klorida disukai. Tindak balas medium nutrien, yang disukai oleh kebanyakan bakteria patogen, sedikit alkali, yang sepadan dengan pH = 7.2-7.4. Vibrio cholerae tumbuh pada pH = 7.8-8.5, cendawan - pada pH = 5-5.5. Media kultur harus lembap, yakni mengandung jumlah air yang cukup, selembar dan steril mungkin, iaitu, sebelum menyemai, tidak mengandungi mikroba.
Dari segi komposisi dan asal, media nutrien adalah semula jadi, buatan dan sintetik. Media budaya semula jadi adalah produk semula jadi seperti kentang dan sayur-sayuran lain. Media nutrien buatan disediakan mengikut resipi khusus dari produk dengan penambahan sebatian organik dan bukan organik. Media sintetik mengandungi sebatian kimia tertentu dalam kepekatan yang diketahui.
Secara konsisten, media nutrien adalah cecair, separa cair, padat. Agar-agar-polisakarida yang diasingkan dari rumput laut biasanya digunakan sebagai sealant. Agar-agar tidak digunakan oleh mikroorganisma sebagai nutrien; membentuk gel dalam air yang mencair pada suhu 100 ° C dan padat pada suhu 45 ° C.
Untuk mendapatkan medium nutrien padat, agar-agar ditambahkan pada kepekatan 1,5-2%, untuk separa cair - 0,5%.
Mengikut tujuan yang dimaksudkan, media budaya dapat dibahagikan kepada diagnostik biasa (sederhana), khas, elektif, pembezaan.
Media nutrien konvensional (sederhana) digunakan untuk penanaman kebanyakan mikroorganisma, ini adalah mesopatamia broth (MPB), mesopatamia agar (MPA).
Media nutrien khas digunakan untuk penanaman mikroorganisma yang tidak tumbuh pada media sederhana. Contohnya, agar darah dan kaldu gula untuk streptokokus, agar serum untuk meningococcus dan gonococcus.
Media kultivatif elektif digunakan untuk mengasingkan satu spesies dari campuran bakteria yang berbeza. Bakteria jenis ini tumbuh di persekitaran ini lebih cepat dan lebih baik daripada yang lain, melebihi pertumbuhannya; pertumbuhan bakteria lain ditangguhkan pada medium ini. Contohnya, serum yang dibekukan untuk difteri bacillus, air peptone alkali untuk kolera vibrio, kaldu empedu untuk kepialu tifoid, media garam untuk staphylococcus.
Media kultur diagnostik pembezaan digunakan untuk membezakan beberapa jenis bakteria dari yang lain berdasarkan aktiviti enzimatiknya (lihat bahagian yang sesuai).
Penanaman dan pengasingan kultur murni bakteria aerobik
Untuk penanaman mikroorganisma, keadaan tertentu diperlukan: suhu, keadaan aerobik atau anaerobik.
Suhu mestilah optimum untuk spesies. Sebilangan besar bakteria patogen berkembang pada suhu 37 ° C. Namun, bagi beberapa spesies, suhu yang lebih rendah adalah optimum, kerana keunikan ekologi mereka. Oleh itu, untuk wabak bacillus, habitat semula jadi adalah tikus semasa hibernasi, suhu optimum ialah 28 ° C, begitu juga untuk leptospira, untuk bacillus botulisme - 28 ° C-35 ° C.
Sebagai tambahan kepada suhu optimum, untuk penanaman mikroorganisma, bergantung pada spesies, diperlukan persekitaran aerobik atau anaerobik.
Untuk mengkaji morfologi, budaya, biokimia dan sifat mikrob lain, perlu memperoleh budaya murni. Biasanya kultur mikroba disebut pengumpulannya pada medium nutrien dalam bentuk kekeruhan, pertumbuhan dekat-bawah (dinding) atau filem di permukaan medium cair atau koloni pada medium yang padat. Koloni tunggal terbentuk dari satu sel mikrob. Budaya murni adalah budaya mikrob spesies yang sama yang diperoleh dari satu koloni. Di makmal, strain mikrob tertentu yang diketahui digunakan untuk pelbagai kajian. Strain adalah kultur mikrob murni yang diperoleh dari sumber tertentu, pada masa tertentu, dengan sifat yang diketahui. Biasanya, strain mikroba ditentukan oleh nombor tertentu. Sebagai contoh, strain Staphylococcus aureus 209P digunakan untuk menentukan aktiviti penisilin.
Pengasingan kultur aerob murni biasanya memakan masa tiga hari dan dilakukan mengikut skema berikut:
Hari pertama - mikroskop smear dari bahan ujian, diwarnai (biasanya oleh Gram) - untuk kenalan awal dengan mikroflora, yang dapat berguna dalam memilih media kultur untuk inokulasi. Kemudian suntikan bahan di permukaan agar-agar nutrien beku untuk mendapatkan koloni terpencil. Penyaringan boleh dilakukan mengikut kaedah Drygalsky menjadi tiga piring Petri dengan medium nutrien. Setetes bahan digunakan pada cawan pertama dan disebarkan ke seluruh cawan dengan spatula. Kemudian, dengan spatula yang sama, sebarkan budaya yang tinggal di atasnya pada cawan kedua dan dengan cara yang sama pada yang ketiga. Jumlah jajahan terbesar akan tumbuh di lempeng pertama, paling sedikit di ketiga. Koloni terpencil akan tumbuh di salah satu pelat, bergantung pada berapa banyak sel mikrob dalam bahan ujian.
Hasil yang sama dapat dicapai dengan mengayak pada satu cawan. Untuk melakukan ini, bahagikan cawan menjadi empat sektor. Bahan yang dikaji diinokulasi dengan gelung bakteriologi dengan pukulan pada sektor pertama, kemudian, setelah menetap dan menyejukkan gelung, inokulasi diedarkan dari sektor pertama ke sektor kedua dan dengan cara yang sama secara berurutan ke sektor ketiga dan keempat. Koloni terpencil terbentuk dari sel mikrob individu selepas inkubasi setiap hari dalam termostat.
Hari ke-2 - kajian mengenai tanah jajahan yang ditanam di atas pinggan, penerangannya. Koloni boleh menjadi lut sinar, lut sinar atau legap, ia mempunyai ukuran yang berbeza, garis bulat biasa atau tidak teratur, bentuk cembung atau rata, permukaan licin atau kasar, permukaan licin atau bergelombang, bergerigi. Mereka boleh berwarna atau putih, emas, merah, kuning. Berdasarkan kajian ciri-ciri ini, koloni yang ditanam dibahagikan kepada beberapa kumpulan. Kemudian koloni terpencil dipilih dari kumpulan kajian, smear disediakan untuk pemeriksaan mikroskopik untuk memeriksa homogenitas mikroba di koloni. Koloni yang sama diinokulasi ke dalam tabung uji dengan agar-agar nutrien.
Hari ke-3 - memeriksa kesucian budaya yang ditanam pada agar-agar dengan mikroskop smear. Dengan homogenitas bakteria yang dikaji, pengasingan budaya murni dapat dianggap lengkap.
Untuk mengenal pasti bakteria terpencil, sifat budaya dikaji, iaitu sifat pertumbuhan pada media nutrien cair dan pepejal. Sebagai contoh, streptokokus pada kaldu gula membentuk sedimen bahagian bawah dan parietal, pada agar darah - kecil, menunjukkan koloni; kolera vibrio membentuk filem di permukaan air peptone alkali, dan koloni telus pada agar alkali; wabak wabak pada agar nutrien membentuk koloni dalam bentuk "sapu tangan renda" dengan pusat yang padat dan tepi bergelombang nipis, dan dalam medium nutrien cair - filem di permukaan, dan kemudian filamen memanjang darinya dalam bentuk "stalaktit ".
Penanaman dan pengasingan kultur murni bakteria anaerob
Untuk penanaman anaerob, perlu menurunkan potensi pengurangan oksidasi medium, untuk membuat anaerobiosis dengan mengeluarkan oksigen dengan kaedah fizikal, kimia atau biologi.
Kaedah fizikal merangkumi:
1) penyingkiran udara secara mekanikal melalui pam dari anae-rostat, di mana piring dengan inokulasi diletakkan. Pada masa yang sama, anda boleh mengganti udara dengan gas yang tidak peduli: nitrogen, hidrogen, karbon dioksida.
2) tumbuh dalam medium yang mengandungi zat pengurangan. Kitta-Tarozzi Wednesday adalah kaldu gula dengan potongan hati atau daging. Glukosa dan kepingan organ mempunyai keupayaan mengurangkan. Medium dituangkan di atas dengan lapisan minyak vaseline untuk menyekat akses oksigen udara.
3) Kaedah yang paling mudah, tetapi kurang dipercayai ialah menanam dalam gula agar tinggi.
Kaedah kimia terdiri daripada fakta bahawa piring dengan tanaman anaerob diletakkan di desiccator yang tertutup rapat, di mana bahan kimia diletakkan, misalnya, pyrogallol dan alkali, tindak balas di antaranya diteruskan dengan penyerapan oksigen.
Kaedah biologi didasarkan pada penanaman anaerob dan aerob secara serentak pada media nutrien pepejal dalam piring Petri, ditutup secara hermetik setelah inokulasi. Pertama, oksigen diserap oleh aerob yang tumbuh, dan kemudian pertumbuhan anaerob bermula.
Pengasingan kultur anaerob murni bermula dengan pengumpulan bakteria anaerob dengan inokulasi pada medium Kitta-Tarozzi. Di masa depan, koloni terpencil diperoleh dengan salah satu daripada dua cara:
1) bahan diinokulasi dengan mencampurkan dengan agar-agar gula cair dalam tiub kaca. Setelah agar menjadi padat, koloni terpencil tumbuh di kedalamannya, yang dikeluarkan dengan memotong tiub dan subkultur pada medium Kitt-Tarozzi (kaedah Weinberg);
2) inokulasi bahan dilakukan pada piring dengan medium nutrien dan diinkubasi dalam anaerostat. Jajahan terpencil yang ditanam di atas piring subkultur pada media Kitt-Tarozzi (kaedah Zeissler).
Penanaman mikroorganisma lain
Penanaman mikoplasma
Mycoplasma dikulturkan pada media nutrien yang dilengkapi dengan serum dan karbohidrat. Oleh kerana mikoplasma kekurangan dinding sel, mereka hanya tumbuh di lingkungan isotonik atau hipertonik. Pada media nutrien pepejal, selama beberapa hari, koloni sangat kecil terbentuk, menyerupai telur goreng - dengan pusat cembung dan pinggiran lut rata. Mycoplasmas juga dapat ditanam dalam embrio ayam atau kultur sel.
Penanaman rickettsia dan klamidia
Rickettsiae dan klamidia adalah parasit intraselular. Untuk penanamannya, kultur sel, embrio ayam dan jangkitan haiwan digunakan.
Penanaman cendawan
Untuk penanaman cendawan, media nutrien padat dan cair digunakan: selalunya media Sabouraud, serta media yang mengandungi wort bir. Cendawan tumbuh lebih perlahan daripada bakteria, ia membentuk pertumbuhan yang kelihatan dalam beberapa hari. Suhu penanaman lebih rendah daripada bakteria - 22-30 ° C.
Penanaman spirochetes dan protozoa
Di antara spirochetes, leptospira paling senang tumbuh, yang mana air yang dicampurkan dengan serum darah arnab dapat berfungsi sebagai medium nutrien.Borrelia dan treponema ditanam dalam keadaan anaerob pada media nutrien yang lebih kompleks yang mengandungi serum, kepingan tisu haiwan.
Antara protozoa, disentri amoeba, lamblia, Trichomonas, leishmania, trypanosome, balantidia ditanam pada media nutrien.Toksoplasma ditanam pada embrio ayam dan kultur tisu. Kaedah penanaman untuk plasmodia malaria sedang dikembangkan.
Kaedah untuk mengkaji aktiviti enzimatik (sifat biokimia)
Dalam praktik mikrobiologi, kajian aktiviti enzimatik digunakan untuk mengenal pasti mikroorganisma, kerana setiap spesies mikroba mempunyai sekumpulan enzim tertentu.
Untuk menentukan aktiviti proteolitik, mikroba diinokulasi dengan suntikan ke dalam gelatin gelen, dan setelah inkubasi 3-5 hari pada suhu bilik, watak pencairan gelatin diperhatikan: dalam bentuk corong, kuku, stoking atau dalam bentuk pokok Krismas yang terbalik. Kegiatan protein juga ditentukan oleh pembentukan produk penguraian protein: indole, hidrogen sulfida, ammonia. Untuk menentukannya, mikroorganisma diinokulasi ke dalam kaldu daging-peptone, dan kertas penunjuk diletakkan di antara leher tabung uji dan penyumbat kapas, tidak termasuk hubungannya dengan media. Apabila indole terbentuk, kertas yang diresapi dengan larutan tepu asid oksalik memperoleh warna merah jambu; di hadapan hidrogen sulfida, kertas yang diresapi dengan timbal asetat bertukar menjadi hitam; semasa amonia terbentuk, kertas litmus merah bertukar menjadi biru.
Untuk menentukan sifat sakarolitik mikroba, media diagnostik pembezaan digunakan, seperti media Giss, media Olkenitsky, medium Endo, medium Levin, medium Ploskirev.
Media Endo, Levin, Ploskirev dalam piring Petri digunakan untuk membezakan bakteria dari kumpulan usus dengan kemampuan mereka untuk fermentasi laktosa. Media ini mengandungi agar nutrien, laktosa dan petunjuk yang berubah warna dalam medium berasid - penunjuk pH. Sekiranya anda menyemai bakteria yang memfermentasi laktosa, seperti E. coli, di persekitaran seperti itu, asid akan terbentuk akibat penapaian laktosa, dan penunjuk akan berubah warna di persekitaran yang berasid. Oleh itu, koloni Escherichia coli pada media tersebut akan diwarnakan mengikut warna penunjuk: pada media Endo dan Ploskirev - berwarna merah, pada media Levin - dalam warna hitam dan biru. Koloni bakteria yang tidak fermentasi laktosa, seperti salmonella dan batang disentri, akan berwarna.
Media Giss ("variegated range" media) dibuat berdasarkan air peptone atau agar-peptone daging separa cair. Mengandungi salah satu alkohol karbohidrat atau polihidrat dan petunjuk. Apabila mikroba tumbuh di medium Giss, fermentasi substrat ini dengan pembentukan asid dan gas, medium akan berubah warna, dalam medium semi-cair, gelembung dan pecah akan muncul dalam ketebalan agar, dalam medium cair - a gelembung gas dalam pelampung kaca. Apabila substrat diperam hanya menjadi asid, hanya berlaku perubahan warna medium.
Media gabungan yang tidak mengandungi satu karbohidrat, tetapi dua atau tiga juga digunakan, sebagai contoh, media Olkenitsky. Satu tiub medium ini menggantikan agar slant dan media Giss dengan laktosa, glukosa dan sukrosa. Setelah pensterilan dalam keadaan lebur, medium dalam tabung uji dibongkarkan sehingga tiang dan bahagian serong diperoleh. Menyemai dilakukan dengan pukulan pada bahagian serong dan tusukan di lajur. Ketika laktosa atau sukrosa diperam, warna keseluruhan medium berubah; ketika satu glukosa ditapai, hanya warna lajur yang berubah. Pembentukan gas ditunjukkan oleh adanya gelembung di lajur agar. Apabila mikroba melepaskan amonia, warna medium tidak berubah. Pembentukan hidrogen sulfida ditunjukkan dengan menghitamkan dalam jadual agar
Untuk kaedah ekspres untuk menentukan aktiviti enzimatik bakteria, sistem microtest dan sistem kertas penunjuk (NIB) digunakan
Sistem microtest adalah bekas yang terbuat dari polistirena lutsinar, yang terdiri daripada beberapa sel. Sel mengandungi media nutrien kering dengan karbohidrat dan petunjuk pH. Suspensi kultur bakteria dengan ketumpatan tertentu diinokulasi ke dalam setiap sel. Larutan garam dituangkan ke dalam sel kawalan.warna
penunjuk
Sistem kertas penunjuk (NIB) untuk pengenalpastian keluarga enterobacteriaceae adalah cakera atau helai kertas kromatografi, ditutup dengan filem pelindung dan mengandungi substrat tertentu dan penunjuk. Dengan mengubah warna penunjuk Untuk menentukan hidrogen sulfida, cakera adalah diletakkan di permukaan MPA, disuntik dengan suntikan, yang memungkinkan untuk menentukan pergerakan secara serentak
Di semua tabung uji, keputusan awal pada hari yang sama dan keputusan akhir pada hari berikutnya diambil kira.
Aktiviti oksidase ditentukan dengan menggosok kultur pada kertas petunjuk.Hasilnya diambil kira setelah satu minit.
Tisu TANAMAN DAN SEL TANAMAN
Penanaman sel dan tisu terpencil pada media nutrien buatan dalam keadaan steril (in vitro) menerima nama kaedah kultur tisu terpencil.
Oleh kerana tanaman benih sangat penting dalam kehidupan manusia, kaedah dan keadaan penanamannya dikembangkan lebih baik daripada untuk gimnosperma atau alga, penanaman yang dalam keadaan steril menyebabkan kesulitan tertentu. Walau bagaimanapun, tanpa mengira kepemilikan tumbuhan kepada kumpulan taksonomi tertentu, ada syarat umum untuk penanaman objek dalam budaya. secara in vitro.
Asepsis. Pertama sekali, penanaman serpihan tisu atau organ tumbuhan - eksplan, dan lebih-lebih lagi sel individu, memerlukan asepsis lengkap. Mikroorganisma yang boleh memasuki medium nutrien melepaskan toksin yang menghalang pertumbuhan sel dan membawa kepada kematian kultur. Oleh itu, untuk semua manipulasi dengan sel dan tisu semasa penanamansecara in vitro amati peraturan asepsis tertentu di dalam kotak laminar atau di bilik aseptik. Dalam kes pertama, asepsis dicapai dengan membekalkan udara steril yang ditapis yang diarahkan dari kotak laminar ke luar kepada pekerja. Bilik aseptik disterilkan menggunakan lampu ultraviolet, dan mereka bekerja di bilik seperti itu dengan pakaian steril. Permukaan meja di bilik dan alat aseptik juga disterilkan dengan alkohol sebelum bekerja.
Bersihkan pinggan yang sebelumnya dibalut dengan kertas atau kerajang, alat, kertas, bulu kapas disterilkan dengan api kering dalam oven pada suhu 160 ° C selama 1.5-2 jam. Media kultur disterilkan dalam autoklaf pada suhu 120 ° C dan tekanan tinggi dalam masa 15 - 20 minit. Sekiranya media kultur mengandungi bahan yang terurai semasa melakukan autoklaf, bahan tersebut harus disterilkan dengan penapisan melalui penapis bakteria. Kemudian komponen yang ditapis steril ditambahkan ke medium autoklaf yang disejukkan hingga 40 ° C.
Tisu tumbuhan sendiri boleh menjadi sumber jangkitan yang serius, kerana mikroflora epifit selalu berada di permukaannya. Oleh itu, pensterilan permukaan diperlukan, yang dilakukan seperti berikut. Sebelumnya, bahagian tanaman dari mana eksplan akan diekstrak dicuci dengan sabun dan air dan dibilas dengan air bersih. Kemudian bahan tanaman disterilkan dalam larutan pembasmi kuman. Sebilangan bahan ini, serta masa pensterilan ditunjukkan dalam jadual. 6.1.
|
Jadual 6.1 Pensterilan bahan tanaman asal (menurut R.G.Butenko, 1999) Sebuah objek |
Masa pensterilan, min |
||
|
diasid 0.1% |
merkuri klorida 0.1% |
hidrogen peroksida, 10-12% |
|
|
Benih kering |
15-20 |
10-15 |
12-15 |
|
Benih membengkak |
6-10 |
6-8 |
6-8 |
|
Tisu batang |
20-40 |
20-25 |
— |
|
Daun |
1-3 |
0,5-3 |
‘ 3-5 |
|
Apex |
1-10 |
0,5-7 |
2-7 |
Setelah menyimpan eksplan dalam larutan disinfektan, mereka dibasuh beberapa kali dalam air suling dan lapisan luar sel pada irisan eksplan dikeluarkan dengan pisau bedah, kerana boleh rosak semasa pensterilan.
Mikroorganisma juga terdapat di dalam tisu tumbuhan. Jangkitan dalaman paling kerap berlaku pada tanaman tropika dan subtropika. Oleh itu, selain pensterilan permukaan, kadang-kadang perlu menggunakan antibiotik, yang membunuh flora mikroba di dalam tisu. Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan bahawa rawatan sedemikian tidak selalu menyebabkan pensterilan tisu dalaman, kerana sukar untuk memilih antibiotik yang disasarkan.
Media budaya. Sel dan tisu terpencil dikultur pada media nutrien multikomponen. Mereka boleh berbeza dengan ketara dalam komposisi mereka, namun komposisi semua media semestinya merangkumi unsur makro dan mikro yang diperlukan untuk tumbuhan, karbohidrat, vitamin, fitohormon dan analog sintetiknya. Karbohidrat (biasanya sukrosa atau glukosa) termasuk dalam formula pemakanan pada kepekatan 2-3%. Mereka diperlukan sebagai komponen pemakanan, kerana kebanyakan tisu kalus kekurangan klorofil dan tidak mampu melakukan pemakanan autotrofik. Oleh itu, mereka ditanam dalam keadaan pencahayaan yang tersebar atau dalam gelap. Pengecualian adalah tisu kalus mandrake, amaranth dan beberapa tumbuhan lain.
Komponen media kultur yang sangat diperlukan harus menjadi auksin, yang menyebabkan dedifferensiasi sel eksplan, dan sitokinin, yang mendorong pembelahan sel. Apabila nisbah antara fitohormon ini berubah atau ketika fitohormon lain ditambahkan, pelbagai jenis morfogenesis dapat disebabkan.
Kandungan nitrat, ion ammonium, kalium, fosfat yang tinggi mendorong pertumbuhan sel yang cepat. Penipisan persekitaran mengurangkan pertumbuhan dan proses metabolisme sekunder dengan ketara. Walau bagaimanapun, kandungan fosfat pada awalnya rendah dalam medium nutrien dapat merangsang sintesis metabolit sekunder. Didapati bahawa penanaman licorice calli pada medium dengan separuh kepekatan nitrogen dan fosforus dalam kegelapan meningkatkan kandungan sebatian fenolik sebanyak 1.6 kali berbanding dengan kali yang tumbuh pada medium yang lengkap. Endosperma embrio yang belum matang (kelapa, chestnut kuda, dll.), Getah beberapa pokok, pelbagai ekstrak (malt, ragi, jus tomato) dapat ditambahkan ke medium. Memperkenalkan mereka dengan persekitaran. memang memberikan hasil yang menarik, tetapi percubaan seperti itu sukar dibuat semula, kerana bahan aktifnya biasanya tidak diketahui dengan tepat. Sebagai contoh, menambahkan pecahan santan yang terpisah ke medium nutrien tidak memberikan apa-apa hasil, sementara endosperma yang tidak dipecah menyebabkan pembelahan sel.
Semasa menyediakan media nutrien padat untuk penanaman permukaan tisu kalus, digunakan agar-agar yang disucikan, polisakarida yang diperoleh dari rumput laut. Sebagai contoh dalam jadual. 6.2 menunjukkan komposisi media budaya yang paling biasa.
Persekitaran Murashige dan Skoog adalah yang paling serba boleh. Ia sesuai untuk pembentukan kalus, pemeliharaan pertumbuhan kalus yang tidak teratur, dan induksi morfogenesis pada kebanyakan tanaman dikotledon. Oleh itu, perubahan dalam nisbah auxin dan kinetin membawa kepada pembentukan kedua-dua akar (dominasi auxin), atau; tanaman batang (dominasi kinetin).
Medium Gamborg dan Eveleg sangat sesuai untuk penanaman sel dan tisu kekacang dan bijirin, medium White menyediakan * perakaran tunas dan pertumbuhan normal batang setelah pertumbuhan semula, dan medium Nitsch dan Nitsch sesuai untuk induksi andro-igenesis dalam budaya anter.
Faktor fizikal. Untuk pertumbuhan dan pengembangan tisu tumbuhan; secara in vitro faktor fizikal - cahaya, mempunyai pengaruh yang besar; suhu, pengudaraan, kelembapan. |
Cahaya. Sebilangan besar tisu kalus boleh tumbuh dalam keadaan cahaya rendah atau gelap, kerana ia tidak mampu membuat fotografi *; mensintesis.Pada masa yang sama, cahaya dapat bertindak sebagai faktor yang memberikan morfogenesis dan proses pengaktifan untuk kali kedua.
|
!Komposisi media nutrien yang digunakan dalam penanaman sel dan tisu (selepas R.G.Butenko, 1999) |
Kepekatan media nutrien, mg / l |
|||
|
Komponen media |
Murashige dan |
Gamborg dan |
Putih, |
Nich dan Nich, |
|
Skoog, 1962 |
Evelega, 1968 |
1939 |
1974-1975 |
|
|
KN03 |
1900 |
3000 |
81 |
950 |
|
NH4NO3 |
1650 |
— |
— |
720 |
|
Ca (N03)2 |
— |
— |
142 |
— |
|
Ca (N03)2-4H20 |
— |
— |
— |
— |
|
(NH4)2S04 |
— |
134 |
— |
— |
|
MgS04-7H20 |
370 |
500 |
74 |
185 |
|
CaCl2H20 |
— |
— |
166 |
|
|
CaClr2H20 |
440 |
150 |
— |
— |
|
KC1 |
— |
65 |
— |
|
|
KH2P04 |
170 |
— |
12 |
68 |
|
NaH2P04H20 |
— |
150 |
— |
— |
|
MnS04H20 |
— |
10 |
— |
— |
|
MnS0 „-4H20 |
22,3 |
— |
— |
25 |
|
ZnS04-4H20 |
8,6 |
— |
— |
— |
|
ZnS04-7H20 |
— |
2 |
— |
10 |
|
H3B04 |
6,2 |
3 |
— |
10 |
|
CuS04-5H20 |
0,025 |
0,075 |
— |
0,025 |
|
Na2Mo04-2H20 |
0,25 |
0,25 |
— |
0,25 |
|
CoCl2-6H20 |
0,025 |
— |
— |
— |
|
FeS04-7H20 |
27,8 |
— |
— |
27,8 |
|
Na EDTA-2H20 |
37,3 |
— |
— |
37,3 |
|
Sequestrene 330-Fe |
28 |
— |
— |
|
|
Mesoinositis |
100 |
— |
— |
200 |
|
Vitamin C |
— |
— |
— |
3 |
|
Tiamin-HCl |
0,5 |
— |
— |
3 |
|
Piridoksin-HCl |
0,5 |
— |
— |
1 |
|
Asid nikotinik |
0,5 |
— |
— |
— |
|
Sukrosa |
30 000 |
20000 |
2000 |
60 000 |
|
Agar "Difco", gel |
— |
— |
— |
7000 |
|
rith, agarose |
||||
sintesis. Lampu pendarfluor digunakan sebagai sumber cahaya. Bagi kebanyakan tumbuhan herba, pencahayaan optimum adalah sekitar 1000 lux. Pencahayaan yang terlalu rendah (300 lux) atau tinggi (3000-10,000 lux) menghalang pertumbuhan. Pencahayaan boleh mempengaruhi metabolisme sel kalus. Oleh itu, dalam budaya tanaman teh, biosintesis polifenol meningkat di bawah pengaruh cahaya. Sebaliknya, dalam kultur sel Parodi-flora Scopolia cahaya menekan pembentukan alkaloid. Selain intensiti pencahayaan, kualiti cahaya mempengaruhi kultur tisu dan ciri fisiologinya. Oleh itu, lebih daripada 20 flavon dan glikosida flavonol terbentuk dalam kultur sel pasli setelah diterangi dengan cahaya bercahaya berterusan "putih dingin". Pada masa yang sama, sintesis glikosida flavon diaktifkan oleh penyinaran berturut-turut dengan sinar ultraviolet, dan kemudian oleh cahaya yang terletak di wilayah "merah-gelombang-panjang merah"
Suhu. Bagi kebanyakan kultur kalus, suhu optimum ialah 26 ° C. Pada masa yang sama, kultur calli dan sel Dioscorea deltoid tumbuh dengan baik walaupun pada suhu 32 ° C. V Tidak seperti pertumbuhan kultur sel dan tisu, induksi morfogenesisnya memerlukan suhu yang lebih rendah (18 - 20 ° C). Kesan suhu pada metabolisme sel secara in vitro kurang belajar. Terdapat bukti bahawa dalam kultur kalus, pembentukan alkaloid maksimum diperhatikan pada suhu 25 ° C, dan dengan peningkatan suhu, penurunan tajam. Dalam kultur sel penggantungan Ipomoea kandungan asid lemak meningkat dengan ketara jika ditanam pada suhu pertumbuhan suboptimal (15 ° C) Oleh itu, semasa menanam kultur secara in vitro adalah perlu untuk mengkaji dengan teliti pengaruh semua faktor abiotik, termasuk suhu, terhadap pertumbuhan dan metabolisme sel.
Pengudaraan. Untuk penanaman tanaman penggantungan, pengudaraan sangat penting. Terutama penting untuk membekalkan sel kultur dengan udara dalam fermenter dalam jumlah besar.
Semasa membandingkan pelbagai jenis fermenter, ditunjukkan bahawa sintesis metabolit sekunder dalam kultur suspensi paling hebat apabila udara dibekalkan dari bawah. Apabila tumbuh sel dalam jumlah kecil (dalam termos), pengudaraan normal dicapai dengan pengadukan penggantungan berterusan.
Kelembapan. Kelembapan optimum di bilik tempat saya tumbuh! Tanaman mestilah 60 - 70%.
Oleh itu, penanaman sel dan tisu bergantung pada banyak faktor persekitaran luaran, dan tindakan mereka tidak selalu baik? stno. Oleh itu, semasa memperkenalkan spesies tanaman baru ke dalam budaya, perluT Pertama sekali, perlu mengkaji dengan teliti pengaruh faktor fizikal terhadap pertumbuhan dan ciri fisiologi budaya ini.
Penanaman sel dan tisu terpencil pada media nutrien buatan dalam keadaan steril (in vitro) disebut kaedah kultur tisu terpencil.
Oleh kerana tanaman benih sangat penting dalam kehidupan manusia, kaedah dan keadaan penanamannya lebih baik dikembangkan daripada gimnosperma atau alga, penanaman yang di bawah keadaan steril menyebabkan kesulitan tertentu. Walau bagaimanapun, tanpa mengira kepemilikan tumbuhan kepada kumpulan taksonomi tertentu, ada syarat umum untuk penanaman objek dalam budaya in vitro.
Asepsis. Pertama sekali, penanaman serpihan tisu atau organ tumbuhan - eksplan, dan lebih-lebih lagi untuk sel individu, memerlukan asepsis lengkap.Mikroorganisma yang dapat memasuki medium nutrien melepaskan toksin yang menghalang pertumbuhan sel dan menyebabkan kultur mati, oleh itu, selama semua manipulasi dengan sel dan tisu semasa penanaman in vitro, peraturan aseptik tertentu diperhatikan.
Media budaya. Sel dan tisu terpencil dikultur pada media nutrien multikomponen. Mereka boleh berbeza dengan ketara dalam komposisi mereka, namun komposisi semua media semestinya merangkumi unsur makro dan mikro yang diperlukan untuk tumbuhan, karbohidrat, vitamin, fitohormon dan analog sintetiknya. Karbohidrat (biasanya sukrosa atau glukosa) termasuk dalam campuran nutrien pada kepekatan 2-3%. Mereka diperlukan sebagai komponen pemakanan, kerana kebanyakan tisu kalus kekurangan klorofil dan tidak mampu melakukan pemakanan autotrofik. Oleh itu, mereka ditanam dalam keadaan pencahayaan yang tersebar atau dalam gelap. Komponen mandatori media budaya harus menjadi pembantu yang menyebabkannya dedifferensiasi sel eksplan, dan sitokinin yang mendorong pembahagian sel. Apabila nisbah antara fitohormon ini berubah atau apabila fitohormon lain ditambahkan, pelbagai jenis morfogenesis.
Faktor fizikal. Pertumbuhan dan perkembangan tisu tumbuhan in vitro sangat dipengaruhi oleh faktor fizikal - cahaya, suhu, pengudaraan, kelembapan. Sebilangan besar tisu kalus boleh tumbuh dalam keadaan cahaya rendah atau gelap kerana tidak dapat melakukan fotosintesis. Pada masa yang sama, cahaya dapat bertindak sebagai faktor yang memberikan morfogenesis dan mengaktifkan proses sintesis sekunder. Bagi kebanyakan kultur kalus, suhu optimum ialah 26 ° C. Untuk penanaman tanaman penggantungan, pengudaraan sangat penting. Terutama penting untuk membekalkan sel kultur dengan udara dalam fermenter dalam jumlah besar. Kelembapan optimum di dalam bilik di mana tanaman tumbuh mestilah 60-70%. Oleh itu, penanaman sel dan tisu bergantung pada banyak faktor persekitaran, dan kesannya tidak selalu diketahui. Oleh itu, semasa memperkenalkan spesies tumbuhan baru ke dalam budaya, pertama sekali perlu mempelajari pengaruh faktor fizikal terhadap pertumbuhan dan ciri fisiologi budaya ini.
Tarikh Ditambah: 2016-06-02; pandangan: 493;
LIHAT LAGI:
Proses berkembang sel dan kain pada media nutrien tiruan dalam keadaan steril (in vitro) dipanggil kaedah mendapatkan kultur tisu terpencil. Kultur tisu terpencil biasanya kalus dan lebih jarang tisu tumor (rajah 3.1. dan 3.2).
Kultur sel dan tisu terpencil.
Menggunakan budaya sel dan tisu terpencil.
Kultur tisu terpencil banyak digunakan dalam pengeluaran pertanian dan perindustrian. Mereka mempunyai kelebihan berbanding dengan bahan tanaman tradisional (tanaman liar dan tumbuh-tumbuhan), iaitu:
1. Kemerdekaan dari keadaan luaran.
2. Pengoptimuman keadaan tumbuh.
3. Automasi dan pengkomputeran proses.
4. Keupayaan untuk menanam spesies tumbuhan yang terancam.
5. Kemungkinan mikropropagasi klon massa buah dan sayur-sayuran dan tanaman hiasan.
6. Pemulihan daripada jangkitan virus dan lain-lain.
7. Peluang melalui budaya secara in vitro, memperluas bidang pekerjaan pembiakan, iaitu untuk mendapatkan klon sel, kemudian tumbuh-tumbuhan dengan sifat yang diprogramkan.
Kerana kemampuan sel untuk mensintesis dalam budaya metabolit sekunder, muncul cabang industri baru, yang menjalankan sintesis biologi bahan yang diperlukan untuk manusia.
Syarat untuk penanaman tisu dan sel.
Penanaman serpihan tisu atau satu tumbuhan - eksplan, dan lebih-lebih lagi untuk sel individu, memerlukan asepsis lengkap.
Mikroorganisma yang boleh memasuki medium kultur mengeluarkan toksinmenghalang pertumbuhan sel dan menyebabkan budaya mati. Oleh itu, semua manipulasi dengan sel dan tisu semasa penanaman secara in vitro dilakukan dengan mematuhi peraturan asepsis tertentu di kotak lamina atau di bilik aseptik. Asepsis dicapai dengan membekalkan udara steril yang melewati penapis, yang diarahkan dari kotak lamina ke luar. Di permukaan tisu tumbuhan selalu ada mikroflora epifit. Oleh itu, perlu dilakukan pensterilan permukaan, yang dicapai dengan merawat kawasan tanaman dari mana mereka akan mengasingkannya eksplan, pembasmi kuman (hidrogen peroksida, klorida merkuri).
Untuk bekerja dengan bahan biologi, komponen berikut diperlukan:
- membersihkan pinggan dan bioreaktor (fermenter);
- medium nutrien steril;
- pencahayaan optimum;
- suhu optimum;
- kelembapan optimum;
- pengudaraan.
Bersihkan pinggan dan fermenter. Instrumen dan bulu kapas yang sebelumnya dibalut dengan kertas atau kerajang disterilkan oleh panas kering di pengeringan kabinet pada suhu 160 ° C selama 1.5-2 jam.
Semasa menggunakan pelbagai jenis fermenter, didapati bahawa sifat fisiologi kultur dapat berubah; oleh itu, sintesis metabolit sekunder dalam kultur penggantungan harus dilakukan dengan bekalan udara dari bawah. Dalam keadaan ini, sintesis berjalan lebih aktif (Gamb. 3.3).
Apabila tumbuh sel dalam jumlah kecil, misalnya, dalam termos, pengudaraan normal dicapai dengan pengadukan penggantungan berterusan.
Media budaya... Penanaman sel dan tisu terpencil berlaku dalam pelbagai komponen media nutrien... Mereka boleh berbeza dalam komposisi mereka, namun komposisi semua media semestinya merangkumi komponen asasnya, di mana kumpulan bahan yang diperlukan untuk tumbuhan ditambahkan: unsur makro dan mikro, karbohidrat, vitamin dan fitohormon. Asas komponen seperti itu adalah agar-agar - polisakarida rumput laut, mampu membentuk gel dalam air yang padat pada suhu 45 ° C. Boleh ditambah ke medium budaya endosperma embrio belum matang (kelapa, chestnut kuda), sirap sebilangan pokok, berbeza ekstrak (malt, ragi), jus tomato. Pengenalan mereka ke alam sekitar memberikan hasil yang positif. Walau bagaimanapun, setiap komponen aktif mempunyai ciri teknologi yang melekat padanya.
Nasi. 3.3. Bioreactor (fermenter) untuk pertumbuhan mikroorganisma, sel atau tisu
Dedifferentiation adalah asas proses pembentukan kalus.
Dedifferentiation adalah kembalinya sel-sel khusus ke keadaan meristematik apabila mereka memperoleh kemampuan untuk membelah.
Organ dan tisu tumbuhan berfungsi sebagai bahan permulaan untuk memperoleh kultur sel dan tisu, namun daun tanaman lebih kerap digunakan untuk ini.
Serpihan daun steril yang sebelumnya dikerjakan diletakkan pada medium nutrien padat. Daun terdiri daripada tisu yang berlainan, sel-selnya dibezakan dan mensintesis pelbagai molekul protein, karbohidrat, lipid, dan bahan lain yang menjadi ciri sel ini. Sel yang dibezakan ini tidak mempunyai keupayaan untuk membahagi.
Dalam proses kerosakan mekanikal pada helaian eksplan dilepaskan, dan di bawah pengaruh hormon tumbuhan ditambahkan ke persekitaran, auksin dan sitokinin sel dibezakan. Ia kehilangan bahan simpanan - pati, protein, lipid, organel khusus, kloroplas, dan lain-lain. Akibatnya, semua sel memperoleh sifat morfologi dan fisiologi dekat baru, iaitu. menjadi sel kalus (membahagi). Tisu kalus terbentuk pada eksplan daun.
Jenis kultur sel. Bergantung pada kaedah dan keadaan penanaman, terdapat beberapa jenis kultur sel dan tisu:
- budaya kalus;
- budaya penggantungan;
- kultur sel tunggal.
Sekiranya penanaman berlaku secara dangkal pada medium nutrien agar, kemudian tisu kalus terbentuk. Ia tidak mempunyai struktur yang jelas, tetapi kepadatannya berbeza-beza. Keadaan asal dan berkembang menentukan sama ada tisu kalus longgar, berketumpatan sederhana, atau padat.
Ciri umum sel kalus. Sel kalus mempunyai sebilangan sifat yang sama dengan semua sel tumbuhan... Ini adalah ontogeni sel, ketahanan terhadap faktor persekitaran tertentu dan sifat lain. Pada masa yang sama, semasa penanaman mereka, sel kalus memperoleh ciri-ciri individu mereka sendiri, seperti asinkron fisiologi, heterogenik genetik, dan beberapa yang lain.
Asinkron fisiologi terletak pada kenyataan bahawa pada setiap saat sel-sel berada dalam fasa pertumbuhan yang berlainan: ada yang membelah, yang lain tumbuh, dan yang lain sudah tua. Oleh itu, penuaan fisiologi umum seluruh populasi sel kalus biasanya dinilai oleh keadaan kebanyakan sel (Gambar 3.4).
Nasi. 3.4. Sel kalus diNasi. 3.5. Protoplast keluar melalui
Tarikh Ditambah: 2016-05-28; pandangan: 1915;
Artikel serupa:
